Kategorie: Aktuell

Praktikum Krebs-Diagnostik p53 im Elisabeth Kalko Labor der Experimenta in Heilbronn

Am  31.01.2024 besuchte der Leistungskurs Biologie die Experimenta in Heilbronn, um molekularbiologische Arbeitstechniken zu erlernen. Ein zentraler Schwerpunkt lag dabei auf dem Nachweis von Mutationen im p53-Gen, einem bedeutenden Tumorsuppressor-Gen.  

Nach der Sicherheitseinweisung konnten die Experimente auch schon starten. Die Experimente begannen mit einer theoretischen Einführung in die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) und den Restriktionsverdau. Die PCR ermöglicht die gezielte Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen, während der Restriktionsverdau die DNA an bestimmten Stellen schneidet. Diese beiden Techniken wurden kombiniert, um Mutationen im p53-Gen nachzuweisen. Frau Wolff war es wichtig, dass wir PCR, Gelelektrophorese und ELISA auch mal praktisch durchführen, und nicht nur theoretisch im Unterricht behandeln sollten. Somit war die theoretische Einlage für uns aus dem Bio-Leistungskurs zu einem großen Teil Wiederholung, was in Sicht auf das ausstehende Abitur, sicher nicht schlecht ist. Das übergeordnete Thema, welches wir an diesem Tag behandeln sollten, war Krebsdiagnostik. Krebserkrankungen sind in Deutschland die zweithäufigste Todesursache. Die Erforschung der Ursache und Therapie-Möglichkeiten spielt eine große Rolle in der Medizin. Nach einer allgemeinen Pipettierübung konnten wir schon mit der PCR starten. Beim Li-Fraumeni-Syndrom handelt es sich um eine erbliche Veranlagung zur Ausbildung bösartiger Tumore. Hier liegt eine Mutation im p53 Tumorsuppressor-Gen auf Chromosom 17 vor. Wir sollten untersuchen, ob die drei Test-Patienten am Li-Fraumeni-Syndrom erkrankt sind und falls ja, ob die Erkrankung homozygot (also von beiden Eltern) oder heterozygot (nur von einem Elternteil) vererbt wurde. Die DNA-Proben wurde zuerst mittels PCR vervielfältigt, um ausreichend DNA für den Restriktionsverdau zu erhalten. Nach der PCR wurde die DNA mit Restriktionsenzymen behandelt. Die Restriktionsenzyme schneiden spezifisch, an der Stelle der DNA-Sequenz, die mutieren kann. Ist eine Mutation des p53-Gens vorhanden, schneidet das Restriktionsenzym die DNA-Sequenz in zwei Teile, liegt keine Mutation vor, wird die DNA-Sequenz nicht zerschnitten.

Während die PCR lief, machten wir mit dem ELISA-Test weiter. Geprüft werden sollte, ob sich in Proben künstlicher Testpersonen p53 Antikörper befinden. Wenn sich Antikörper im Blut befinden, kann eine Tumorerkrankung vermutet werden. Tritt also beim ELISA Test ein Farbstoff auf, sind die p53-Gen-Antikörper beim Patienten vorhanden. Die Negativprobe, sollte somit keine Farbe aufweisen, was auch bei allen von uns funktionierte. Durch die Farbintensitäten der Eichansätze und den Vergleich dieser mit dem Ergebnis der drei Patienten, konnten die Patienten, in verschiedene Stufen eingeordnet werden. So konnte ein Befund negativ, positiv oder in einem kritischen Bereich sein. Mit dem bloßen Auge sah es so aus, als hätte bei uns allen der ELISA-Test sehr gut funktioniert. Bei einer genauen Betrachtung mithilfe eines Photometers, fiel jedoch auf, dass unsere Ergebnisse doch nicht so gut waren, wie wir auf den ersten Blick dachten. Nun diskutierten wir noch welche medizinischen Schlüsse man aus einem positiven oder negativen ELISA Testergebnis ziehen kann.  

Als die PCR fertig war durften wir nur noch die Gelelektrophorese durchführen. Hier läuft die DNA-Sequenzen mit den hinzugegebenen Restriktionsenzymen, durch ein elektrisches Feld mit Agarosegel. Kürzere DNA-Sequenzen, kommen dabei weiter als lange. Somit ist es möglich nachzuweisen, ob das Restriktionsenzym geschnitten hat, und eine Mutation im p53-Gen vorliegt, oder nicht. Da man einen DNA-Fluoreszenfarbstoffe benötigt, um die DNA sichtbar machen und dieser unter starkem Verdacht steht krebserregend zu sein, wurden die echten DNA-Proben von technischen Assistenten verarbeitet. Wir durften aber ein Agarosegel und die TAE-Pufferlösung herstellen. Statt der DNA-Proben haben wir die Geltaschen mit einer gefärbte Glycerinlösung befüllt.  Wir wurden gewarnt, dass dies eine schwierige Aufgabe sei, dennoch haben wir alle die Taschen getroffen. Nach der 30 minütigen Laufzeit bei 150 V hat man auf dem Floureszenzbildschirm (Geldok) schön gesehen, dass entweder zwei kurze (das Restriktionsenzym hat geschnitten), oder ein langes (das Restriktionsenzym hat nicht geschnitten) zu sehen waren. Aus den Ergebnissen konnten wir ebenfalls ermitteln, ob eine Person erblich, doppelt belastet und die Mutation von beiden Eltern vererbt bekam, oder nur von einem. 

Insgesamt war das Schülerpraktikum im Elisabeth Kalko Labor der Experimenta Heilbronn eine bereichernde Erfahrung, die uns v.a. praktische Fertigkeiten in der Molekularbiologie und Immunbiologie vermittelte. Die Möglichkeit, die im Unterricht besprochenen Methoden in der Praxis anzuwenden, hat unser Verständnis für diese komplexen Themen vertieft und uns für die spannende Welt der wissenschaftlichen Forschung begeistert, auch wenn wir jetzt wissen, dass man im Labor viel pipettieren und warten muss.

Text: Janne Hautzinger K2
Bilder: Dr. Doris Wolff